脱细胞材料在组织再生中的应用

脱细胞材料（Decellularized materials，DMs）由于其固有的结构、较高的生物活性、较低的免疫原性和良好的生物降解性，难以被人工合成材料所模仿，越来越受到人们的关注。近年来，DMs被证明在克服自体移植物的缺点方面具有巨大的潜力，是一种很有前途的组织工程材料。

随着医学技术的发展，人们对生物材料提出了越来越高的要求，即不仅要具有良好的生物相容性、无毒性和合适的力学性能，还要具有与细胞外基质（ECM）相似的作用。也就是说，它们应该能够为细胞提供特殊的生理条件，以产生所需的细胞反应，并将其发育成新的组织或器官。为了构建与细胞外基质相似的生物材料，许多细胞外基质分子如胶原蛋白和蛋白多糖（PG）被用作原材料。仿生设计已成为生物材料领域的研究热点。然而，单个分子不能起到整个ECM的作用，其组成和结构的复杂性也使得其难以复制。因此，脱细胞材料（DMs）在各种生物材料中表现突出，并因其保持了与ECM相似的组成和结构而被广泛研究。

为了了解DMs的研究现状，我们通过科学网（webofscience）检索了相关文献（检索日期：2019年12月31日）。“脱细胞”近年来逐渐增多的相关文献表明，DMs正受到越来越多的关注，各种组织和器官已经脱细胞并应用于组织工程。DMs主要是通过物理、化学、生物等方法从动物或人的组织器官中去除细胞和一些抗原成分制备的。脱细胞后，保留活性成分和一些非抗原成分，如多糖、胶原、糖蛋白、纤维连接蛋白（FN）等，以保持自然组织和器官的活性、形状以及结构。许多研究表明，DMs可以在一定程度上克服自体移植和其他组织工程支架材料的缺点。此外，去除抗原和细胞成分可以降低不良反应的风险，如移植部位的炎症和免疫排斥反应。因此，DMs是有望在组织工程中发挥越来越重要的作用。然而，DMs本身也存在一些不足，如降解不可控、力学性能不足等，目前已有大量的研究来弥补其不足，发挥其优势。

来源于不同组织/器官的DMs已被广泛研究。目前，大部分组织已经成功脱细胞并应用于组织修复。研究最多的组织可能是脱细胞真皮和小肠黏膜下层（SIS），其中以胶原纤维和弹性纤维为主的脱细胞真皮广泛应用于烧伤治疗、耳鼻喉科手术、肌腱修复、腹部、乳腺、口腔颌面部，目前，脱细胞真皮制备的产品相当丰富，主要有AlloDerm、Axist、AlloMaxt、AlloPatch、Axis dermis、Collamendt、Epiflex、DermaMatrix、GraftJacket、Medeor Matrix、FlexHD、Matriderm、Surgimendtsurgimendmind PRS、Repliform、InteXent、Xenformt、Permacolt、Strattice、Gelfoam、，另一方面，据报道，脱细胞SIS主要由Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅳ型胶原和丝素蛋白组成。自从1966年SIS作为一种血管替代物问世以来，已成为组织修复领域的研究热点。此外，SIS已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，并逐步应用于临床修复食管、尿道、膀胱、腹部、硬脑膜、胃粘膜、肌腱和韧带、心血管系统等。到目前为止，FDA批准的SIS产品主要包括Oasis、Surgisis、Cor MatrixECM、Cuff Patcht、Meso Bio Matrix、Restore、Stratasis、Surgisis、Durasis等。

由于脱细胞和后处理的难度不同，不同的组织在不同的阶段发展，包括小动物实验、大动物实验、临床试验或产品。除脱细胞真皮和SIS外，一些脱细胞组织如脱细胞间皮、骨基质（ABM）、血管、心包、瓣膜、角膜、半月板已作为产品用于临床应用。除此之外，脱细胞气管和脱细胞脂肪组织的最新研究主要处于临床试验阶段，这将为今后相关疾病的治疗带来新的方法。除此之外，脱细胞食管上皮等脱细胞复合组织主要集中在大动物实验中，脱细胞软骨的研究仍处于小动物实验阶段。

就脱细胞组织而言，脱细胞的脑ECM可作为一种活性剂，为神经和脊髓损伤修复提供生化线索，并促进生物相容性。脱细胞耳蜗已被应用于内耳组织工程，近年来，脱细胞膀胱基质和脱细胞尿道在尿道重建和膀胱壁修复方面的研究越来越多，胎盘基质及羊膜逐渐增多，已应用于临床。对于去细胞器官，去细胞胰腺因其在解决补血困难、促进胰岛素分泌细胞功能等方面的潜力而备受关注，总之，尽管目前对这些DMs的研究还不够深入，但它们在组织工程组织器官修复方面仍有很大的潜力。

DMs通常可以作为（多层）片状或管状、粉末、溶液、水凝胶、3D打印生物油墨、静电纺丝等应用。

来源于不同组织和器官的DMs已广泛应用于组织工程，并显示出许多优点。DMs具有独特结构、生物活性物质、免疫应答相对较弱、生物降解性好、降低器官置换难度等优点。

去除自然组织中的细胞和其他抗原成分后导致DMs的多孔结构。具有合适直径的内连接孔是组织工程支架的重要组成部分，它可以为细胞的代谢提供结构支撑，保证营养物质更好的交换，促进细胞的粘附和增殖。

此外，这些复杂的三维结构的一个非常明显的优点是，它们是由ECM组件按照基因控制的发育程序自组装而成，作为生命进化的选择，为细胞提供最合适的环境。同时，在宏观和微观尺度上保持DMs的结构完整性，产生了与支架天然组织相似的拉伸强度。许多研究已经证明了ECM超微结构和力学对细胞行为、迁移和分化、器官特异性细胞命运决定的潜在影响，然而，这些天然的三维结构很难，甚至不可能通过工程方法被模仿，这使得DMs在组织工程，特别是复杂组织的修复和器官的重建方面具有优越性。

DMs中保留的一些天然微结构，如血管结构，为组织尤其是血管组织的修复提供了优先考虑的条件。迄今为止，构建具有完整血管系统的再生组织仍然是一个挑战，它决定了组织重建的成功与否。然而，已有研究表明，灌注脱细胞后，包括毛细血管在内的天然血管系统可以得到保存，促进组织器官的重建，这为DMs在组织工程中的应用提供了巨大的潜力和优势。

来自不同组织的脱细胞材料有其组织特异性成分。大多数组织中的主要成分包括胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖（GAG）、蛋白聚糖（PG）、纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白和生长因子，如成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、骨形态发生蛋白（BMP-2）等，据报道，脱细胞猪脑中含有GAG、胶原和各种分子，如组织因子、CD26、内皮抑素、成纤维细胞生长因子-1（FGF-1）、FGF-2、IGFBP-9和骨桥蛋白。脱细胞后的肝脏可保留I型胶原、IV型胶原，纤维连接蛋白和层粘连蛋白。此外，值得注意的是，最近有报道称基质结合纳米囊泡（MBV）是DMs的一个组成部分和功能成分，Badylak等人在2016年首次发现了这一点。所有这些成分都被证明是促进组织重建的生物活性物质。

首先，胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白等基本成分已被证明具有独特的生物学功能来指导细胞行为。例如，已有研究表明，胶原基支架可显著促进成纤维细胞和肝细胞的增殖，促进牙周组织细胞的增殖和分化，促进内皮细胞的粘附，以及毛细血管样网络的形成。透明质酸可促进成纤维细胞和肝细胞的增殖。

此外，值得注意的是，DMs中的ECM分子在蛋白水解降解的作用下会释放出隐藏的片段，这会显著影响ECM的组装、聚合和ECM生长因子复合物的形成，并在组织修复和器官替换中发挥重要作用。例如，通过切割母体分子（如胶原）产生的基质隐藏肽具有抗菌活性或促进趋化性、血管生成、有丝分裂和分化的活性，并可作为干/祖细胞的趋化因子。同样，主要来源于纤维连接蛋白和胶原的Arg-Gly-Asp（RGD）肽也被发现参与细胞粘附过程的最著名的肽。而且，RGD肽构象从环状到线形的变化可显著改变整合素识别的特异性，从而刺激不同的细胞反应，包括分化和表型维持。此外，层粘连蛋白（LM）衍生肽，主要包括IKVAV（促进皮层神经元突起生长和诱导神经元分化）和YIGSR，它们能够诱导血管生成，抑制肿瘤生长和转移，促进皮肤发育，也因其独特的生物功能而参与其中。同样，疏水序列VGVPG和VGVAPG来源于弹性蛋白，能刺激平滑肌细胞增殖，促进成纤维细胞、单核细胞和巨噬细胞的趋化性。多种生长因子通过与细胞表面受体结合或与ECM的其他组分相互作用，直接调控细胞行为，特别是具有血管生成、抗菌、趋化等生物学活性，MBVs的生物学效应包括促进巨噬细胞向抗炎M2样表型分化、细胞存活、258生长和增殖、迁移和分化。

总的来说，尽管其机制尚不明确，但这些丰富的生物活性物质为DMs提供了刺激干细胞和祖细胞向再生部位迁移的能力，从而为细胞向所需方向分化提供合适和稳定的生存环境，并促进组织重建，例如，在肌腱修复模型中，当使用膀胱基质DM进行修复时，发现多能祖细胞向损伤部位迁移。此外，已证明DMs在体外可招募成肌干细胞和祖细胞，在体内可招募263个Sox2p细胞，在体外和体内可招募264个骨骼肌成肌细胞，因此，DMs无需外源性干细胞移植即可实现组织再生。也就是说，从患者体内收集内源性干细胞可以稳定地维持一个有效的干细胞库，这对组织修复非常重要，脱细胞材料可以通过改变缺陷部位的局部微环境，使内源性干细胞和祖细胞归宿。

DMs所含的生物活性物质具有诱导细胞分化的潜力，在组织重建方面显示出巨大的优势。DMs类型的多样性使其能够满足不同组织修复的特殊要求。

尽管免疫应答在一定程度上被证明是组织再生所必需的，因为生物材料可以调节免疫应答，为组织重塑创造更有利的微环境，但严重的免疫排斥和炎症反应会导致修复效果严重降低甚至恶化缺陷状态。DMs由于其低免疫原性和免疫调节能力，已被证明能引起相对较弱的免疫应答。

通常情况下，脱细胞后大部分细胞、抗原组分和其他物质会被去除，导致DMs的免疫原性降低。体内研究表明，长度小于200 bp的DNA不会引发明显的炎症反应。并且，已经证明暴露于DMs降解产物的巨噬细胞具有高抗炎和抗原呈递能力的表型，即使在苛刻的促炎微环境中，如体积性肌肉萎缩或溃疡性结肠炎。可能不希望的炎症巨噬细胞/T细胞宿主对DMs的反应主要归因于不完全脱细胞过程中残留的抗原成分。因此，优化脱细胞和后处理方法可以进一步降低DMs的免疫原性。

DMs诱导的免疫应答相对较弱，可以在一定程度上克服同种异体移植在这方面的不足，显示出优越性，达到满意的修复效果。随着脱细胞和后处理方法的改进，有望获得更合适的免疫原性。

DMs在组织器官再生过程中起着重要的作用，因为DMs不仅能调节修复过程，而且在修复完成后能自然降解。DMs主要由天然可降解的胶原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、多糖等组成，可以用无毒的降解产物完全降解。研究表明，DMs的体内降解机制主要包括细胞途径和酶途径。炎症细胞可通过产生氧化剂和蛋白酶来介导这一过程。负责降解ECM的主要蛋白酶家族是基质金属蛋白酶（MMP）（23个已鉴定的家族成员）和具有血小板反应蛋白基序的金属蛋白酶家族（ADAMTS）（19个已鉴定的家族成员）。

目前，许多研究表明，它们具有良好的生物降解性。Rae等发现14C标记的SIS支架在植入3个月后可以迅速降解90%以上，并被新组织所替代。此外，在犬跟腱修复模型中，SIS支架在植入后30天降解率为60%，在手术后90天降解率为100%。另一项研究显示SIS支架的降解率更快，无交联的脱细胞肌腱支架在植入后第9周可完全降解。因此，相对良好的生物降解性使DMs具有生物相容性。它们的生物活性降解产物在组织工程中具有很大的吸引力。

       Helemed公司全系产品Vegraft™、Vesponge™、Vembrane™采用了脱细胞核心技术，以猪真皮、羊胃膜为主要原材料，保留了以细胞外基质为主要组分的活性物质，具有优秀的促进骨组织、肌肉组织、真皮组织和血管再生能力。